# monocle3算法

## 用途

利用monocle3 算法对空间转录组和单细胞数据进行轨迹推断，自动输出多种轨迹相关结果。

## 运行方式

* **使用细胞注释后的h5ad，准备rds文件**

```bash
SDAS dataProcess h5ad2rds -i st.h5ad -o outdir 
```

* **运行monocle3**

```bash
SDAS trajectory monocle3 -i st.rds -o outdir --root_key anno_spotlight --root CAF_DES \
--gene_symbol_key real_gene_name \
--batch_key sampleID
```

## 输入参数说明

| 参数                             | 是否必须  | 默认值              | 描述                                                   |
| ------------------------------ | ----- | ---------------- | ---------------------------------------------------- |
| **-i / --input**               | **是** |                  | rds文件，要求有原始表达矩阵                                      |
| **-o / --output**              | **是** |                  | 输出文件夹                                                |
| **--root\_key**                | **是** |                  | meta.data中根节点所在的列名称                                  |
| **--root**                     | **是** |                  | 设置为根节点的名称                                            |
| --assay                        | 否     |                  | rds文件中用于分析的assay名称，若不设置则用当前默认assay                   |
| --gene\_symbol\_key            | 否     | real\_gene\_name | rds文件中基因名(symbol)的列名（meta.features），\_index 表示用矩阵的列名 |
| --batch\_key                   | 否     |                  | 进行批次校正的meta.data列名，不输入则不做去批次                         |
| --resolution                   | 否     |                  | leiden聚类的resolution参数，不输入则算法会自适配                     |
| --use\_existing\_umap\_cluster | 否     |                  | 使用rds已有的umap和cluster信息                               |
| --umap\_key                    | 否     | umap             | 输入rds存储umap信息的名称                                     |
| --cluster\_key                 | 否     | leiden           | 输入rds存储cluster信息的名称                                  |
| --deg                          | 否     |                  | 分析随拟时序变化的差异基因则输入”--deg”                              |
| --n\_cpus                      | 否     | 8                | 多线程数                                                 |
| --top\_gene\_num               | 否     | 5                | 随拟时序变化的top差异基因数目的表达图                                 |
| --gene\_file                   | 否     |                  | 自定义基因列表文件路径，画基因随拟时序变化的表达趋势图                          |
| --gene\_color\_label           | 否     | pseudotime       | 基因图展示的列的名称                                           |
| --pval\_cutoff                 | 否     | 0.05             | 差异基因筛选p值                                             |
| --qval\_cutoff                 | 否     | 0.05             | 差异基因筛选q值                                             |
| --seed                         | 否     | 42               | 随机种子                                                 |

## 输出结果展示

| 结果文件                                              | 描述                              |
| ------------------------------------------------- | ------------------------------- |
| `<input_name>_dimension.png/pdf`                  | 降维图，展示细胞在低维空间的分布结构              |
| `<input_name>_dimension_color_by_batch.png/pdf`   | 以批次信息展示的降维图（有做批次校正时输出），用于评估批次效应 |
| `<input_name>_cluster.png/pdf`                    | 聚类图，展示细胞聚类分布情况                  |
| `<input_name>_roots.png/pdf`                      | root图，显示轨迹分析的根节点位置              |
| `<input_name>_pseudotime.png/pdf`                 | 拟时序图，展示细胞的拟时序分布                 |
| `<input_name>_top_genes_in_pseudotime.png/pdf`    | 拟时序变化的top基因表达趋势图                |
| `<input_name>_custom_genes_in_pseudotime.png/pdf` | 拟时序变化的自定义基因表达趋势图                |
| `<input_name>_monocle3.rds`                       | 包含轨迹分析结果的rds文件                  |
| `<input_name>_pseudotime.csv`                     | 细胞的拟时序结果，记录每个细胞的拟时序值            |
| `<input_name>_deg_trajectory.xls`                 | 随拟时序变化的所有基因的结果                  |

* **降维图**：`<input_name>_dimension.png/pdf` 展示细胞在低维空间的分布结构,反映整体异质性和分群结构

<figure><img src="https://2512275466-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FaaKaKxoqTIFT7FAUUQFl%2Fuploads%2Fj60M7qH1K2bpMOHBVSJP%2F_dimension.png?alt=media&#x26;token=1e2a77cb-c3a0-454c-9486-238560f9608e" alt="" width="375"><figcaption></figcaption></figure>

* **聚类图**：`<input_name>_cluster.png/pdf` 展示细胞聚类分布，反映整体异质性和分群结构

<figure><img src="https://2512275466-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FaaKaKxoqTIFT7FAUUQFl%2Fuploads%2FqoZogPwPCCol8NVlQkr0%2F_cluster.png?alt=media&#x26;token=c9ff7f62-b813-4080-b742-c34da0a3d771" alt="" width="375"><figcaption></figcaption></figure>

* **root图**：`<input_name>_roots.png/pdf` 展示轨迹分析的根节点，标记轨迹推断的起始点（根节点），用于后续拟时序排序

<figure><img src="https://2512275466-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FaaKaKxoqTIFT7FAUUQFl%2Fuploads%2F5cN0nMyDkYthiACR6TCy%2F_roots.png?alt=media&#x26;token=98d954ed-5fbe-4282-9b3b-e1247ba80bc4" alt="" width="375"><figcaption></figcaption></figure>

* **拟时序图**：`<input_name>_pseudotime.png/pdf` 展示细胞拟时序分布,细胞按推断的发育/转化顺序着色，反映动态变化过程

<figure><img src="https://2512275466-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FaaKaKxoqTIFT7FAUUQFl%2Fuploads%2Fa6s0NGbf4mwKacBuq0RT%2F_pseudotime.png?alt=media&#x26;token=816214b8-7462-404d-aec1-b9f21393e455" alt="" width="375"><figcaption></figcaption></figure>

* **拟时序变化的top基因表达趋势图**：`<input_name>_top_genes_in_pseudotime.png/pdf` 展示拟时序变化最显著的top基因表达趋势

<figure><img src="https://2512275466-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FaaKaKxoqTIFT7FAUUQFl%2Fuploads%2FptzDw1ZBK4fOFjMBXOuc%2Ftop_genes_in_pseudotime.png?alt=media&#x26;token=ef68c4f5-701a-42f4-b3b3-0a48c216f1db" alt="" width="375"><figcaption></figcaption></figure>

* **拟时序变化的自定义基因表达趋势图**：`<input_name>_custom_genes_in_pseudotime.png/pdf` 展示用户指定基因在拟时序过程中的基因表达趋势

<figure><img src="https://2512275466-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-x-prod.appspot.com/o/spaces%2FaaKaKxoqTIFT7FAUUQFl%2Fuploads%2FptzDw1ZBK4fOFjMBXOuc%2Ftop_genes_in_pseudotime.png?alt=media&#x26;token=ef68c4f5-701a-42f4-b3b3-0a48c216f1db" alt="" width="375"><figcaption></figcaption></figure>

## 调参建议

monocle3的轨迹分析一般需以细胞亚型精准注释为前提。通过亚型划分，算法可排除无关细胞干扰，聚焦于具有发育连续性的细胞群体，从而推断符合生物学逻辑的分化路径。**实际分析中，推荐选取特定细胞群体，不要使用全片进行分析，同时可降低运行时间和内存。**