单细胞/pseudobulk差异分析

用途与运行方式

1. 单细胞水平差异分析（无生物学重复）

支持t-test、wilcoxon、MAST

• 场景一：指定类别1与类别2差异分析

  SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key leiden --de_method wilcoxon  \
  --ident1 1 --ident2 2 \
  --fdr 0.05 --log2fc 1

• 场景二：每个类别与其余类别分别做差异分析

  SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key leiden --de_method wilcoxon \
   --fdr 0.05 --log2fc 1 

• 场景三：对obs的某列做子集后再差异分析

  SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key leiden --de_method wilcoxon \ 
  --ident1 1 --ident2 2 \
  --fdr 0.05 --log2fc 1 \
  --subset_key cell_type --subset_values B

2. pseudobulk差异分析（有生物学重复）

推荐DESeq2、edgeR（pseudobulk分析），需指定--sample_key，且每组样本数需满足方法要求（DESeq2≥3，edgeR≥2）

• 场景一：两组样本直接差异分析

  SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key sampleID --de_method DESeq2 \ 
  --ident1 Tumor --ident2 Normal \
  --fdr 0.05 --log2fc 1 \
  --sample_key sampleID

• 场景二：子集后做pseudobulk差异分析

  SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key sampleID --de_method DESeq2 \ 
  --ident1 Tumor --ident2 Normal \
  --fdr 0.05 --log2fc 1 \
  --sample_key sampleID \
  --subset_key cell_type --subset_values B

输入参数说明

DEG参数	是否必须	默认值	描述
-i / --input	是		Stereo-seq h5ad，要求原始矩阵
-o / --output	是		分析结果存放路径
--de_method	是		指定差异分析方法：{t-test,wilcoxon,MAST,DESeq2,edgeR}
--group_key	是		需要进行差异分析的对象所在的obs名称
--ident1	否		用于分析差异表达基因的对象，类似处理组，不写则按1-vs-rest方式逐个输出
--ident2	否		用于做对照的对象，类似对照组，不写则将剩余元素当作对照，类似1-vs-rest
--sample_key	否		存放样本信息的obs名称，使用DESeq2或edgeR时进行pseudobulk差异分析时必须指定且必须存在生物学重复样本，使用DESeq2时必须有>=3个生物学重复，使用edgeR时必须有>=2个生物学重复
--subset_key	否		需要提取的值所属的分组列名称
--subset_values	否		需要提取的值，存在多个时用','分隔
--layer	否		指定表达矩阵，不指定时用adata.raw.X或adata.X
--gene_symbol_key	否	real_gene_name	指定genename所在列，默认用obs.real_gene_name
--fdr	否	0.05	Padj（FDR）的阈值，用于筛选显著差异基因
--log2fc	否	1	log2FC的绝对值阈值，用于筛选显著差异基因
--genelist	否	5	在图中标出感兴趣的基因，多个基因可用','分隔，默认用显著上调和下调各5个基因
--add_label	否		对h5ad的obs增加额外的标签
--min_gene	否	0	一个bin/cell允许的最少基因数
--max_gene	否		一个bin/cell允许的最多基因数
--min_cell	否	0	某个基因最少存在于多少个bin/cell中

输出结果展示

结果文件	描述
de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.raw.csv	软件原始的输出结果
de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.all.csv	从原始结果中提取出geneID、log2FC、Pvalue、FDR等信息的结果
de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.sig_filtered.csv	根据log2FC和Pvalue过滤后的显著差异结果
de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.png/pdf	png或pdf格式的火山图

• raw文件格式示例：de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.raw.csv 这个文件是差异分析软件生成的分析结果，里面可能包含除了基因名、差异倍数、Pvalue、adjusted Pvalue（FDR）等信息外的其他信息。

names	scores	logfoldchanges	pvals	pvals_adj
MTATP6P1	16.74336	1.3794351	1.3877341418899603e-42	2.2785333033340524e-39
AGR2	13.671169	1.7758344	1.419568544127444e-32	1.1147316293689464e-29
CLDN4	13.663365	1.9820584	1.9626883546881656e-34	1.6880054463820458e-31
...	...	...	...	...

• all/sig_filtered文件格式示例：de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.all.csv 文件是从差异分析软件生成的分析结果中提取了基因名、差异倍数、Pvalue、adjusted Pvalue（FDR）重新统一命名后的结果文件，de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.sig_filtered.csv文件是根据log2FC和FDR阈值进行筛选后得到的显著差异基因列表。

gene	log2FC	pvalue	FDR
MTATP6P1	1.3794351	1.3877341418899603e-42	2.2785333033340524e-39
AGR2	1.7758344	1.419568544127444e-32	1.1147316293689464e-29
CLDN4	1.9820584	1.9626883546881656e-34	1.6880054463820458e-31
...	...	...	...

• 火山图结果示例: de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.png/pdf 图中红色的点表示同时达到log2FC和FDR筛选阈值的显著差异基因，蓝色的点表示达到FDR筛选条件但没达到log2FC条件的基因，绿色的点表示达到log2FC筛选条件但没达到FDR条件的基因，同时，默认会在图中标出差异倍数最高和最低的5个基因，如果需要在图中标注指定的基因，可以通过genelist参数进行指定(例如， --genelist geneA,geneB,geneC)。

结果解读说明

1. 基因名唯一化

   • 差异分析前会自动对基因名进行make_unique，所有输出和作图均使用唯一化后的基因名。

2. 细胞和基因过滤

   • 支持通过--min_gene、--max_gene、--min_cell等参数对细胞和基因进行过滤。若h5ad已过滤，可不再设置。

调参建议

1. 超过200k的bin/cell数据量时MAST无法成功运行，这种情况下可以通过设置更严格的过滤参数（min_gene和min_cell）减少bin/cell的数量再进行分析。