单细胞/pseudobulk差异分析

用途与运行方式

1. 单细胞水平差异分析（无生物学重复）

支持t-test、wilcoxon、MAST

场景一：指定类别1与类别2差异分析

SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key leiden --de_method wilcoxon  \
--ident1 1 --ident2 2 \
--fdr 0.05 --log2fc 1

场景二：每个类别与其余类别分别做差异分析

SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key leiden --de_method wilcoxon \
 --fdr 0.05 --log2fc 1

场景三：对obs的某列做子集后再差异分析

SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key leiden --de_method wilcoxon \ 
--ident1 1 --ident2 2 \
--fdr 0.05 --log2fc 1 \
--subset_key cell_type --subset_values B

2. pseudobulk差异分析（有生物学重复）

推荐DESeq2、edgeR（pseudobulk分析），需指定--sample_key，且每组样本数需满足方法要求（DESeq2≥3，edgeR≥2）

场景一：两组样本直接差异分析

SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key sampleID --de_method DESeq2 \ 
--ident1 Tumor --ident2 Normal \
--fdr 0.05 --log2fc 1 \
--sample_key sampleID

场景二：子集后做pseudobulk差异分析

SDAS DEG -i st.h5ad -o outdir --group_key sampleID --de_method DESeq2 \ 
--ident1 Tumor --ident2 Normal \
--fdr 0.05 --log2fc 1 \
--sample_key sampleID \
--subset_key cell_type --subset_values B

输入参数说明

DEG参数

是否必须

默认值

描述

-i / --input

是

Stereo-seq h5ad，要求原始矩阵

-o / --output

是

分析结果存放路径

--de_method

是

指定差异分析方法：{t-test,wilcoxon,MAST,DESeq2,edgeR}

--group_key

是

需要进行差异分析的对象所在的obs名称

--ident1

否

用于分析差异表达基因的对象，类似处理组，不写则按1-vs-rest方式逐个输出

--ident2

否

用于做对照的对象，类似对照组，不写则将剩余元素当作对照，类似1-vs-rest

--sample_key

否

存放样本信息的obs名称，使用DESeq2或edgeR时进行pseudobulk差异分析时必须指定且必须存在生物学重复样本，使用DESeq2时必须有>=3个生物学重复，使用edgeR时必须有>=2个生物学重复

--subset_key

否

需要提取的值所属的分组列名称

--subset_values

否

需要提取的值，存在多个时用','分隔

--layer

否

指定表达矩阵，不指定时用adata.raw.X或adata.X

--gene_symbol_key

否

real_gene_name

指定genename所在列，默认用obs.real_gene_name

--fdr

否

0.05

Padj（FDR）的阈值，用于筛选显著差异基因

--log2fc

否

log2FC的绝对值阈值，用于筛选显著差异基因

--genelist

否

在图中标出感兴趣的基因，多个基因可用','分隔，默认用显著上调和下调各5个基因

--add_label

否

对h5ad的obs增加额外的标签

--min_gene

否

一个bin/cell允许的最少基因数

--max_gene

否

一个bin/cell允许的最多基因数

--min_cell

否

某个基因最少存在于多少个bin/cell中

输出结果展示

结果文件

描述

de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.raw.csv

软件原始的输出结果

de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.all.csv

从原始结果中提取出geneID、log2FC、Pvalue、FDR等信息的结果

de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.sig_filtered.csv

根据log2FC和Pvalue过滤后的显著差异结果

de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.png/pdf

png或pdf格式的火山图

raw文件格式示例：de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.raw.csv 这个文件是差异分析软件生成的分析结果，里面可能包含除了基因名、差异倍数、Pvalue、adjusted Pvalue（FDR）等信息外的其他信息。

names

scores

logfoldchanges

pvals

pvals_adj

MTATP6P1

16.74336

1.3794351

1.3877341418899603e-42

2.2785333033340524e-39

AGR2

13.671169

1.7758344

1.419568544127444e-32

1.1147316293689464e-29

CLDN4

13.663365

1.9820584

1.9626883546881656e-34

1.6880054463820458e-31

...

all/sig_filtered文件格式示例：de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.all.csv 文件是从差异分析软件生成的分析结果中提取了基因名、差异倍数、Pvalue、adjusted Pvalue（FDR）重新统一命名后的结果文件，de_{method}.{group_key}.{ident1}-vs-{ident2}.sig_filtered.csv文件是根据log2FC和FDR阈值进行筛选后得到的显著差异基因列表。

gene

log2FC

pvalue

FDR